Die Besatzung des Föderationsraumschiffs Reliant ist im 23. Jahrhundert auf der Suche nach einem unbelebten Planeten, der für einen Test des Genesis-Projekts geeignet ist. Das geheime Vorhaben, unter der Leitung von Dr. Carol Marcus und ihrem Sohn Dr. David Marcus entwickelt, soll durch Terraforming tote Planeten in zur Besiedlung geeignete Welten verwandeln. Bei der Erkundung eines Wüstenplaneten stoßen Captain Terrell und sein erster Offizier, Commander Chekov, auf Khan, einen durch gentechnische Experimente optimierten Supermenschen und Tyrannen. Er und seine Gefolgsleute sind fünfzehn Jahre zuvor von Captain Kirk auf diesem Planeten ins Exil verbannt worden. Khan macht Chekov und Terrell mit bewusstseinsverändernden Parasiten gefügig und kapert die Reliant, um die Genesis-Technologie in seine Gewalt zu bekommen und Rache an Kirk zu üben.
Der alternde Admiral Kirk befindet sich unterdessen auf Inspektion an Bord seines einstigen Raumschiffs Enterprise, auf dem unter seinem Freund Captain Spock Kadetten ausgebildet werden. Als Dr. Carol Marcus einen Hilferuf sendet, übernimmt Kirk das Kommando. Auf dem Weg zur Wissenschaftsstation trifft die Enterprise auf die Reliant, die plötzlich das Feuer eröffnet. Obwohl sein Raumschiff schwer beschädigt ist, gelingt es Kirk durch einen Bluff, den wieder aufgetauchten Erzfeind Khan kampfunfähig zu machen und ihn in die Flucht zu schlagen.
Auf der Raumstation angelangt, findet Kirk einen Großteil der Wissenschaftler ermordet vor. Terrell und Chekov ließ Khan zwar lebend, aber offenbar traumatisiert zurück. Auf der Suche nach Dr. Carol Marcus und der in einem Torpedo untergebrachten Genesis-Vorrichtung lässt sich Kirk mit seinem Außentrupp in das ausgehöhlte Innere des nahen Planetoiden beamen. Dort trifft er nicht nur Dr. Carol Marcus, mit der er vor Jahren eine Beziehung hatte: Er wird erstmals mit dem gemeinsamen Sohn David konfrontiert, der Kirk die Schuld an der Situation gibt. Terrell und Chekov versuchen im Auftrag Khans mit Waffengewalt, von Kirk und Dr. Carol Marcus die Genesis-Technologie zu erpressen; Terrell wird dabei jedoch wahnsinnig und erschießt sich selbst; Chekov wird ohnmächtig und daraufhin von dem Parasiten verlassen.
Tatsächlich offenbart sich das Planeteninnere als fruchtbare Landschaft: In der Höhle wurde das Genesis-Projekt erfolgreich getestet. Auch ist die Enterprise nicht so stark beschädigt, wie Khan glauben gemacht wurde: Captain Spock kann Kirk und die anderen bald an Bord beamen. Kirk lockt die Reliant mit dem rachsüchtigen Khan an Bord in den Mutara-Nebel, der die wichtigsten Sicherheitsfunktionen beider Raumschiffe außer Kraft setzt: Nur so ist die angeschlagene Enterprise der technisch überlegenen Reliant ebenbürtig.
Dank Kirks größerer Erfahrung kann die Enterprise die Reliant besiegen. Doch als der schwer verwundete Khan die Genesis-Welle aktiviert, um Kirk mit sich in den Tod zu reißen, kann nur die Selbstlosigkeit Spocks das Raumschiff und seine Besatzung retten: Er repariert den Reaktor, damit die Enterprise rechtzeitig mit Warpgeschwindigkeit vor der Explosion flüchten kann. Dabei stirbt Spock aufgrund der radioaktiven Strahlung des Reaktors. Er wird auf dem durch die Explosion der Genesis-Welle neu geschaffenen Planeten beigesetzt.
Vor dem Abspann spricht Spock aus dem Off: „Der Weltraum bleibt die große Herausforderung. Das Raumschiff Enterprise stößt auf seinen Reisen in immer neue Gebiete vor. Es bleibt seine Aufgabe, ungewöhnliche neue Welten zu erkunden, auf die Suche zu gehen nach neuen Lebensformen. Mutig stößt die Enterprise dorthin vor, wo noch kein Mensch gewesen ist.“
William Shatner: Admiral James T. Kirk
Leonard Nimoy: Captain Spock
DeForest Kelley: Dr. Leonard McCoy
James Doohan: Commander Montgomery Scott
George Takei: Lt. Com. Hikaru Sulu
Walter Koenig: Commander Pavel Chekov
Nichelle Nichols: Lt. Com. Nyota Uhura
Merritt Butrick: Dr. David Marcus
Bibi Besch: Dr. Carol Marcus
Kirstie Alley: Lieutenant Saavik
Ricardo Montalbán: Khan Noonien Singh
Paul Winfield: Capt. Clark Terrell
Ike Eisenmann: Peter Preston
John Vargas: Jedda
John Winston: Commander Kyle
Judson Scott: Joaquim